Технология производства низина Антибиотические свойства низина
Р Х Т У
им. Д.И.Менделеева.
Технология
производства низина.
Антибиотические
свойства низина.
Выполнила:
студентка
группы Э-45
Тимошкина Е.А.
10. 05. 1997
НИЗИНЫ (NISINS).
Низины относятся к антибиотикам, которые образуются
собственно бактериями. Антибиотическое вещество - низин - выделен из культуры молочнокислого стрептококка Streptococcus lactis. Низин подавляет развитие
ряда грамположительных и некоторых кислотоустойчивых бактерий, не оказывает
влияния на грамотрицательные бактерии, дрожжи и плесневые грибы. Этот
антибиотик подавляет развитие многих микроорганизмов: пневмококки, группу
стрептококков, различные виды Bacillus , Clostridium, Mycobacterium tuberculosis, Lactobacillus,
Corynebacterium, немногие виды Streptomyces, Micrococcus pyogenes. Низин не оказывает антимикробного
действия на Escherichia
coli, Salmonella typhi, Shigella, некоторые виды Neisseria. Свойства низина, а также особенности его химического
строения привлекли к этому антибиотику внимание ученых. Что касается применения,
следует отметить, что низин не используется в медицинской практике, но с
успехом применяется в ветеринарии для лечения маститов у коров. Также имеет
большое применение в пищевой промышленности в качестве консерванта некоторых
скоропортящихся продуктов, а также для предупреждения порчи сыров. Есть
сообщения об активности низина в отношении малярийного плазмодия, но этот
вопрос пока остается не до конца изученным.
Строение низина.
Установлено, что
низин имеет молекулярную массу, равную 3500, он может полимеризоваться и
образовывать димер (молекулярная масса 7000) и тетрамер. Полимеризацию низина
связывают с наличием в его молекуле дегидроаланина. В состав молекулы низина
входят 30 аминокислотных остатков следующих аминокислот: лизин, гистидин,
аспарагиновая кислота, серин, пролин, глицин, аланин, валин, метионин,
изолейцин, лейцин, остатки редко встречающихся серосодержащих аминокислот: лантионин
и b-метиллантионин,
ненасыщенные аминокислоты - дегидроаланин и
b-метилдегидроаланин.
В 1970 году
установлена следующая структура молекулы низина:
H2N - Иле -
Мга - Ала - Иле - Дга - Лей - Ала - Амк - Про - Глу - Ала -
S S
- Лиз - Амк - Гли - Ала - Лей - Мет - Гли - Ала - Асп - Мет -
Лиз -
S
S
- Амк-Ала- Амк - Ала - Гис -
Ала - Сер - Иле - Гис - Вал - Дга - Лиз - СООН
Дга - дегидроаланин; Амк -
аминомасляная кислота; Мга - b-метилдегид-роаланин. Определено положение
двух сульфидных мостиков, образованных остатками b-метиллантионина. Этот
фрагмент имеет бициклическую структуру:
Биологическая активность
низина обусловлена наличием в его молекуле
a,b-ненасыщенных аминокислот (дегидроаланин, b-метилдегидроаланин). Димеры и тетрамеры
низина, подобно мономеру, обладают биологической активностью. Низин влияет на
споры чувствительных к нему бактерий, которые более богаты катионами по
сравнению с вегетативными клетками, и выступает как катионитный детергент.
Низин, адсорбируясь на поверхности спор, в момент прорастания спор нарушает
прониаемость цитоплазматичесой мембраны и таким образом подавляет рост развивающихся
клеток бактерий. Этот антибиотик способен реагировать с сульфгидрильными
группами биологически важных соединений, выводя их из реакций метаболизма.
Технологические стадии
производства низина.
1.
Приготовление
посевного материала.
Штаммы-продуценты
из пробирок
¯
в колбы со стерильной питательной средой на качалки,
оптимальные tо и рН=6.5 - 6.8.
½
½
½
½
½
½
½
½
½
½
½
½
½
½
½ ½
½
½
½
½
½
½
½
½
¯
Инокуляторы для наращивания посевного материала
(малый посевной аппарат, затем большой посевной аппарат; постоянный долив питательной
среды)
¯
С понижением рН среды увеличивается выделение низина
из клеток в культуральную жидкость. При рН=4.3 более 90% низина выделяется в среду,
а при рН=6.8 выделяется 40% антибиотика.
ü Но интенсивная аэрация
культуры молочнокислого стрептококка не оказывает благоприятного влияния ни на
рост бактерий, ни на образование низина.
Питательная среда: в средах, содержащих недостаточное для
нормального развития количество азота (1-2 мг% NH2
при норме 29
мг%), сильно снижается рост стрептококка и образование антибиотика. Лучшими
азотсодержащими компонентами в средах являются дрожжевой автолизат, пептон,
казеиновый гидролизат. Высокий выход антибиотика наблюдается при развитии
молочнокислого стрептококка на средах, содержащих аммонийные соли органических
кислот.
Источник углерода - глюкоза. Добавление к среде с глюкозой
двух-, трех-, четырех- и пятиуглеродных органических кислот способствует повышению
роста продуцента антибиотика и некоторому увеличению образования им низина.
При засеве свежей питательной среды культурой Streptococcus lactis вместе с посевным материалом вносится и низин, так
как количество общего низина в процессе развития бактерий снижается и к концу
периода лаг-фазы клетки стрептококка практически не содержат антибиотика. А синтез низина происходит после экспоненциального роста бактерий в
период ранней стационарной фазы.
2.
Установка
для биосинтеза антибиотика
½
½
½
½
½
½
½
½
½
½ ½
½
½
½ ½
½
½
½
½
½
½ ½
¯
Снижение общего количества низина в лаг-период
развития Streptococcus
lactis и
синтез антибиотика в более поздний период роста подтверждает значение низина в
качестве важной части бактериального ростового цикла стрептококка (низин,
по-видимому, связан с контролирующим механизмом, который не оказывает влияния
на скорость роста продуцента антибиотика, но задерживает начало роста новых
клеток). Снижение синтеза антибиотика к концу периода лаг-фазы обусловлено
изменением третичной структуры или степени полимеризации антибиотика. Этого
процесса инактивации низина можно избежать путем добавления в среду казеина, в
результате чего наблюдается стабилизация антибиотической активности и большое
образование низина. У низина в отличие от других полипептидных антибиотиков
путь синтеза сходен с путем образования белков, т.е. связан с рибосомным
механизмом. Синтез низина идет через образование низиноподобных
белков-предшественников биосинтеза антибиотика, причем превращение пренизина в
низин происходит под действием фермента на внешней поверхности клетки стрептококка
(есть предположение и о том, что ответственность за биосинтез низина несут
определенные плазмиды, в которых локализованы соответствующие гены образование
молекулы антибиотика). Сам механизм биосинтеза низина и его молекулярная масса
позволяют рассматривать этот антибиотик не как полипептид, а как низкомолекулярный
основной белок.
3. Стадия предварительной обработки
культуральной жидкости, клеток микроорганизма и фильтрации (отделения
культуральной жидкости от биомассы продуцента).
½ ½
½
½
½ ½
½
½
½
½
½
½ ½ ½ ½
¯
В результате рассмотренных аспектов биосинтеза
видно, что образуемый антибиотик почти полностью выделяется из клеток в
культуральную жидкость (бóльшая часть его). Тогда антибиотик
выделяют из культуральной жидкости методами экстракции растворителями, не
смешивающимися с жидкой фазой, осаждают в виде нерастворимого соединения или сорбируют
ионообменными смолами. При содержании антибиотика (как в нашем случае) в
культуральной жидкости и в клетках продуцента, первичной операцией его
выделения является перевод антибиотика в фазу, из которой наиболее целесообразно
его изолировать. При этом антибиотик,
содержащийся в культуральной жидкости, и клетки с антибиотическим веществом,
переводят в осадок, из которого антибиотик экстрагируют. Отделение нативного
раствора от биомассы и взвешенных частиц проводят методами фильтрации
(нутч-фильтр, друк-фильтр, сепараторы) или центрифугирования.
Стадия выделения и очистки
антибиотика
¯
½
½
½
½
½
½
½
½
½
½
½
½
½
½
½
½
½
½
½
½
½
½
¯
Во избежание инактивации антибиотика под влиянием
внешних факторов при его выделении и очистке необходимо соблюдать максимальную
осторожность.
Основные методы очистки:
Метод
экстракции
(Многократный перевод антибиотика из одного растворителя в другой с
предварительным осаждением (кристаллизацией)).
Ионообменная
сорбция
(Пропускание водного раствора антибиотика через колонки с соответствующими
ионообменными смолами, сорбция на них, а раствор с примесями, имеющий
противоположный антибиотику заряд, проходит через колонку. Адсорбированный на
смоле антибиотик элюируют, получают очищенный, концентрированый препарат. А раствор
можно вновь пропустить через ионообменную смолу, но с противоположным зарядом, тогда на смоле осядут примеси, а более
очищенный раствор пройдет через колонку.
Осаждение (Связывание антибиотика с
веществами с целью получения соединения, выпадающего в осадок, который с
помощью фильтров или центрифугирования отделяют от нативного раствора,
промывают, высушивают. Образовавшееся соединение растворяют и антибиотик экстрагируют или вновь осаждают. )
Одна из стадий очистки - концентрирование полученных
растворов (отгонка большей части растворителя в вакууме).
Стадия сушки, получение готовой продукции, изготовление
лекарственных форм (биологический и фармакологический контроль),
расфасовка.
Виды сушки: лиофильная
сушка (при температуре -8, -12 °С)
распылительная
сушилка (раствор
антибиотика пневматически распыляется до мельчайших капель в камере с потоком
нагретого воздуха)
сушка в
вакуум-сушильных шкафах (для высушивания зернистых и пастообразных антибиотических препаратов).
Расфасованный и упакованный антибиотик с указанием показателя
биологической активности, даты выпуска и срока годности поступает в продажу.