Владивостокский
Государственный Медицинский Университет
Кафедра микробиологии, вирусологии и иммунологии
Р е ф е р а т
Холера
Выполнил: Новак А.Л.
301 гр. л/ф
Владивосток, 1998.
Этиология
Возбудитель
холеры относится к роду Vibrio. Это изогнутая,
грамотрицательная, не образующая споры палочка, имеющая один полярно
расположенный жгутик. По чувствительности к специфическому фагу (IV тип по
Мукерджи) различают два биотипа холерного вибриона — классический (возбудитель
азиатской холеры) и Эль-Тор. Каждый из них по 0-антигену подразделяется на 3
серологических типа: Огава (АВ), Инаба (АС) и редко встречающийся Гикошима
(АВС), который некоторые авторы рассматривают как вариант серотипа Огава.
Н-антиген холерных вибрионов — общий для всех серотипов.
Холерные вибрионы образуют
термолабильный экзотоксин — холероген (относительная молекулярная масса — 82—84
кд). Он состоит из комплекса тяжелой субъединицы А, активирующей
аденилатциклазу, и субъединицы В, представленной 4—6 легкими цепями и
обеспечивающей связывание холеро-гена с рецепторами эпителиальных клеток тонкой
кишки.
Биолого-патогенетические свойства возбудителя
Миновав
желудочный барьер, вибрионы попадают в тонкую кишку с благоприятной для них
средой и заселяют (колонизируют) поверхность кишечного эпителия. Процесс
колонизации включает в себя хемотаксис вибрионов к слою слизи, покрывающему
верхушки ворсинок тонкой кишки, проникновение через эту слизь, адгезию к
рецепторам на исчерченной каемке кишечных эпителиоцитов и размножение на
поверхности эпителия ворсинок и крипт. У больных холерой возбудитель может быть
обнаружен на всем протяжении желудочно-кишечного тракта. В желудке при рН не
менее 5,5 вибрионы не обнаруживаются, в стуле их концентрация достигает 106—107
(иногда ^—Ю9).
Размножившись до определенной концентрации,
возбудитель вызывает заболевание посредством вырабатываемого им холерогена.
Основную роль в развитии болезни играют вибрионы, которые находятся в тесной
связи со слизистой оболочкой тонкой кишки, так как они выделяют холероген в
непосредственной близости от его рецепторов на эпителиальных клетках —
ган-глиозида GM1. После прикрепления холерного токсина к ганглиозиду
субъединица А проходит через мембраны внутрь эпителиальной клетки, где происходит
высвобождение фрагмента А1. Последний энзиматически расщепляет НАД и передает
его АДФ-рибозную половину на регуляторный протеин аденилатциклазного комплекса,
находящегося на внутренней стороне мембраны эпителиоцита. В результате
происходит активация аденилатциклазы, приводящая к повышению содержания цАМФ —
одного из внутриклеточных стимуляторов кишечной секреции. Связывание холерного
токсина с рецепторами на эпителиальных клетках происходит чрезвычайно быстро
(через 1—3 мин); биохимические нзменения в клетке являются необратимыми.
Возникающее заболевание сопровождается потерей
огромных количеств жидкости с низким содержанием белка и высокой концентрацией
ионов натрия, калия, хлоридов, гидрокарбонатов. Эта жидкость по составу
отличается как от экссудата, так и от транссудата и ближе к составу кишечного
секрета.
Восприимчивость
К холерному вибриону восприимчивы люди всех возрастов.
Чаще и тяжелее болеют холерой лица, злоупотребляющие алкоголем или перенесшие
резекцию желудка. Кислотность желудочного сока играет важную роль в определении
минимальной инфицирующей дозы — в опытах на добровольцах при нейтрализации
желудочного сока гидрокарбонатом натрия количество вибрионов, необходимых для
воспроизведения специфического процесса у человека, уменьшается с 10" до
104—10Ь
микробных клеток.
Клинические особенности
Инкубационный период при холере длится от 1 до 5
дней. Клинические проявления холеры весьма варьируют, и тяжесть клинического
течения определяется степенью обезвоживания. Заболевание начинается обычно
внезапно. Первым клинически выраженным признаком холеры является понос.
Типичные холерные испражнения представляют собой водянистую, мутновато-беловатую
жидкость с плавающими хлопьями, напоминают по внешнему виду рисовый отвар и не
имеют запаха. Мышечная слабость и судороги в икроножных мышцах — ранние
симптомы холеры. Вслед за жидким стулом появляется обильная повторная рвота,
быстро приводящая к декомпенсированному эксикозу. Кожные покровы становятся
цианотичными, холодными на ощупь, черты лица заостряются, глаза и щеки
западают. Кожа кистей рук морщинистая («руки прачки»), голос сиплый, вплоть до
афонии. У больных с тяжелой формой холеры отмечается гипо-термия. Из-за ее
постоянства терминальная форма холеры (IV степень дегидратации) получила
название «алгидная». Алгид (декомпенсированное обезвоживание) сопровождается
нарушением деятельности основных систем организма — сердечно-сосудистой,
дыхательной, мочевыделительной.
Иммунологическая диагностика
Обнаружение антигена. Возбудитель холеры и его
специфические антигены (корпускулярный, растворимый, холероген) выявляют в
фекалиях, рвотных массах, крови, дуоденальном и кишечном содержимом, желчном
пузыре, в объектах окружающей среды (смывы с различных предметов), в воде
открытых водоемов, сточных водах, гидробионтах и др.
Из современных методов индикации антигенов холерного
вибриона наибольшее распространение получила РНГА, чувствительность которой с
антительными эритроцитарными диагностикумами составляет 105—101'
бактерий в 1 мл или 0,04 мкг/мл 0-антигена. При клинически выраженных формах
холеры, когда в испражнениях больных содержится огромное количество вибрионов
(10'—109 в 1 мл), прямое исследование фильтратов прогретых на
водяной бане испражнений в РНГА с антительным диагностикумом позволяет дать
ответ о наличии специфического антигена уже через 2-—3 ч. Рвотные массы
больных, испражнения вибриононосителей и контактных лиц, содержащие меньшее
количество вибрионов, целесообразно исследовать после предварительного
6-часового подращивания на 1% пептонной воде. При исследовании испражнений и
рвотных масс оказалось, что лишь в 52% случаев диагноз холеры был подтвержден
бактериологически у больных, в анамнезе значительной части которых имелось
указание на употребление антибиотиков при появлении первых признаков
заболевания. С помощью РНГА заболевания холерой удалось дополнительно
установить еще у 21 % больных [Поляков И. И. и др., 1973]. При исследовании
испражнений, содержимого кишечника и желчного пузыря умерших от острых
кишечных заболеваний, испражнений здоровых лиц и проб воды обычно в
практических условиях наблюдали полное совпадение результатов серологического и
бактериологического методов исследования, что позволяет считать РНГА с
антительным эритроцитарным диагностикумом достаточно надежным экспресс-методом
при массовом обследовании на холеру.
Некоторыми авторами при индикации специфических
антигенов холерного вибриона отдается предпочтение РТНГА. Холерные
диагностикумы для этой реакции готовят из бараньих или человеческих О (I)
группы эритроцитов, сенсибилизированных холерными 0-антигенами.
Чувствительность метода — 104—106 бактерий в 1 мл при
исследовании нативных испражнений и 10'—105 — после предварительного
подращивания. Минимальное количество 0-антигена, выявляемого с помощью РТНГА,
равно 0,04—0,16мкг/мл. РТНГА дает положительные результаты у 91% больных
холерой, у 40% ре-конвалесцентов и 12% контактировавших с больными, 0-антиген
холерного вибриона может быть определен через 1 мес от начала заболевания в
фекалиях у всех переболевших людей, а спустя 5—6 мес — у половины обследованных,
что, по-видимому, свидетельствует о более длительной экскреции специфического
антигена в нежизнеспособной форме. Совпадение результатов бактериологического
метода и РТНГА, по различным данным, наблюдается в 63—100% случаев. Имеющиеся
материалы дают основание считать целесообразным широкое испытание РТНГА.
Положительную оценку при диагностике холеры получил
МФА, позволяющий выявлять холерные вибрионы при содержании их не менее 10° в 1
мл. Использовать МФА целесообразно при исследовании нативного материала от
больных и трупов. У больных холерой положительные результаты с помощью МФА были
получены в течение 2 ч в 70—90% наблюдений при полном совпадении с результатами
бактериологического анализа. Применение МФА при исследовании воды и смывов
возможно лишь после предварительного подращивания или концентрирования
материала. Представляется перспективным использование иммунотушевой окраски
холерных вибрионов.
Для выявления антигенов холерного вибриона применяют
агрегат гемаг-глютинационную пробу (АГГ). В основе её лежит использование для
агрегации и фиксирования белков иммунной сыворотки на эритроцитах химического
вещества из группы диазосоединений в виде препарата диазоль черного С.
Эритроциты, сенсибилизированные агрегированными белками холерной 0-сыворотки,
обладают высокой специфичностью и чувствительностью. С их помощью удается определить
0,01—0,005 мкг/мл «цельного» растворенного антигена, приготовленного по методу
Буавена, и 4000—480 000 клеток холерного вибриона в микробных взвесях. Это
позволяет считать АГГ одним из наиболее чувствительных иммунологических
методов, который оправдал себя при обследовании людей. С помощью АГГ 0-антиген
холерного вибриона обнаружен в 88,2% больных холерой и 78,3% вибриононосителей,
причем в титрах 1 : 40 и выше 0-антиген определен у 76,1% больных и у 57,1%
вибриононосителей. Серологически активный компонент эндотоксина обнаруживают в
высоких титрах, чаще у тяжелых больных и в первые 3—5 дней болезни. В период
реконвалесценции количество антигена в сыворотке крови снижается, но у 33%
больных он сохраняется до 20—25 дней [Покровский В. И., Малеев В. В., 1978].
Для определения холерогена, помимо биопроб, используют и иммунологические
методы — РНГА и АГГ. В опытах с бесклеточными супернатантами культур холерных
вибрионов порог чувствительности обоих методов составлял 0,01—0,005 мкг/мл.
Антительный ответ. Инфицирование человека холерным
вибрионом ведет к местному и системному ответу. Клинически выраженное заболевание
холерой сопровождается ростом уровня сывороточных антимикробных
(агглютинирующих и вибриоцидных) и токсиннейтрализующих антител, как правило,
уже к концу 1-й недели после появления симптомов болезни. Агглютинины к
холерному вибриону к 4-му дню заболевания выявляют у 35,7% больных, на 8-й
день — практически у всех (98,6%). Уровень агглютининов достигает максимума на
2-й неделе заболевания (на 11—15-й день титры, равные 320 и выше, регистрируют
у 71% больных), а затем резко падает. Титры вибриоцидных антител также
увеличиваются к 8—10-му дню заболевания и после 3 нед (иногда несколько раньше)
начинают снижаться, достигая первоначального уровня через 2—7 мес. У детей до 4
лет падение титра вибриоцидных антител происходит быстрее, чем в старшей
возрастной группе (5—14 лет), достигая исходного уровня уже через 3 мес.
Динамика титров токсиннейтрализующих антител имеет сходный характер — появляясь
в конце 1-й недели, они достигают максимума между 2-й и 3-й неделями, а с
21-го дня снижаются.
Содержание сывороточных IgM и I gG на протяжении болезни сопоставимо с аналогичными
показателями в контрольной группе, хотя есть данные об увеличении уровня IgM в
острой стадии и снижении его в период реконвалесценции. Некоторые
исследователи не установили разницы в содержании IgA при поступлении больных в
стационар и в стадии реконвалесценции; другие отмечают повышение его уровня у
переболевших [Покровский В. И., Малеев В. В., 1978; Адамов А. К., 1981].
Сказанное не дает достаточных оснований утверждать, что изменение уровня
сывороточных иммуно-глобулинов при холере носит специфический характер.
Специфическая активность иммуноглобулинов различных классов
зависит от формы и длительности инфекционного процесса при холере. Антитела в
сыворотке крови переболевших относятся, преимущественно к IgM. У вибриононосителей
продуцируются, наоборот, высокоактивные IgG-антитела. Активность IgA-антител в
сыворотке крови вибриононосителей незначительно выше по сравнению с больными.
Чем тяжелее протекает заболевание, тем выше активность продуцируемых антител,
относящихся к иммуноглобули-нам класса М, и ниже активность IgG-антител.
Самым простым и легко воспроизводимым методом
определения антимикробных антител является РА с живыми культурами холерного
вибриона, но чувствительность этой реакции ограничена. Диагностические титры (1
:
: 40 и выше) появляются, как правило, к концу
1-й недели заболевания, но лишь у 19,7% больных холерой. Исследование парных
сывороток, полученных с интервалом 7—10 дней при наличии 4-кратного и более
нарастания титров антител увеличивает частоту положительных результатов до
89,6%
Гораздо большее значение
придается в настоящее время выявлению виб-риоцидных антител. Вибриоцидный тест
(ВТ) является более чувствительным в сравнении с РА, давая высокие титры,
особенно у реконвалесцентов холеры (до 1 : 100 000). Нужно, однако, иметь в
виду, что вибриоцидные антитела (титры до 1 : 1000) могут обнаруживаться и в
сыворотках невакцинированных здоровых людей, никогда не болевших холерой, и у
лиц, инфицированных бруцеллами, Yersinia enterocolitica 09, цитробактером. Агглютинины
относительно меньше чувствительны к такой неспецифической стимуляции. Как и РА, ВТ позволяет регистрировать подъем
специфических антител (4-кратный и более) у 90—95% больных с бактериологически
подтвержденным диагнозом холеры [Watanabe Y., 1974].
В качестве антигена в РА и
ВТ используют холерные вибрионы обоих серотипов. При необходимости пользоваться
одним предпочтение отдают серотипу Огава, который чаще, чем Инаба, вступает в
перекрестные реакции с гетерологичным серотипом холерного вибриона и реже дает
неспецифические реакции с микробами других семейств.
Хотя эти серологические
реакции являются наиболее чувствительными, необходимость применения в них живых
вибрионов создает определенные трудности при массовых обследованиях. Поэтому
наибольшего внимания заслуживают антигенные эритроцитарные диагностикумы,
которые позволили внедрить в практику РНГА и РТНГА. Эти реакции обладают
достаточной чувствительностью и специфичностью, позволяя обнаруживать антитела
у больных и переболевших холерой в титрах 1 : 640—1 : 1280. Наблюдаемые
различия в титрах при параллельном использовании РНГА и ВТ обусловлены главным
образом различиями в физико-химической природе выявляемых антител:
IgG-антитела более эффективно обнаруживают бактерицидным методом (ВТ),
IgM-антитела — в РНГА.
Для выявления антитоксинов в
сыворотках применяют РН, результаты которой учитывают по отсутствию
холерогенного эффекта в перевязанной петле тонкой кишки взрослых кроликов, в
кишечнике крольчат-сосунков, на коже морских свинок (кроликов) в опытах in vivo
и по отсутствию цитото-нического действия в культуре клеток СНО и Y-1 — в
опытах in vitro. Наиболее стандартизованы кожная проба и модель
перевязанной кишечной петли. У 73% больных в эндемичном по холере районе с
помощью кожной пробы выявлено диагностически значимое 9-кратное и большее
увеличение титров токсиннейтрализующих антител. Частота сероконверсии
вибриоцидных антител и агглютининов в этой же группе больных была выше и
составила 98 и 88% соответственно [Watanabe Y., 1974].
Анализ титров
антитоксических антител при диареях нехолерной этиологии показал, что в пробах
сывороток, взятых в острой стадии болезни, они колебались от << 10 до
270, но значимое нарастание титров в период рекон-валесценции было отмечено
лишь у 2,5% больных. Обладая высокой специфичностью, метод определения
токсиннейтрализующих антител несколько уступает по чувствительности методам
определения вибриоцидных и агглютинирующих антител. Высокой разрешающей
способностью обладают ИФМ и РИМ, использующие меченный энзимом или
радиоактивным веществом антиген и позволяющие определять связывание 0,001—1 нг
иммунного белка исследуемой сыворотки.
Титры антитоксических антител, регистрируемые ИФМ,
выше титров, которые определяются с помощью внутрикожного теста, что
обусловлено различиями в выявляемых классах иммуноглобулинов: кожный тест документирует
нейтрализующую активность только IgG-антител, вероятно, в силу их большей
авидности, в то время как ИФМ регистрирует и уровень
IgM-антител.
Таким образом, изучение титров и динамики нарастания
циркулирующих антител в сыворотках крови больных при холере расширяет возможности
ее лабораторной диагностики. Ретроспективный диагноз холеры с большей степенью
вероятности может быть установлен в РА и ВТ, но лишь на основании изучения
парных сывороток больных. Определение уровня антитоксина полезно в тех случаях,
когда необходимо исключить предшествующую специфическую вакцинацию, так как
антитела этого типа не индуцируются существующими холерными вакцинами и очень
редко встречаются у здоровых людей. Однако подъем антитоксических титров у
больных на фоне диагностически значимой сероконверсии вибриоцидных и
агглютинирующих антител повышает достоверность серологической диагностики
холеры.
Возникновение патологического процесса, вызванного
холерными вибрионами, ведет к появлению антител к этим микроорганизмам и во
внешних секретах пищеварительного тракта — интестинальной жидкости
(ко-проантитела) и слюне. Отличительной чертой динамики копроантител является
их раннее появление (у 72% — на 2—3-й день болезни, у 100% — на 4-й день) и
быстрое исчезновение из кишечного содержимого. В интестинальной жидкости
выздоравливающих от холеры людей антитела против вибрионов относятся к
иммуноглобулинам A, G и М, но преобладающими являются SIgA-антитела,
количество которых у больных холерой возрастает примерно в 30 раз, но
составляет около '/4 того, что наблюдается у больных диарейными заболеваниями
нехолерной этиологии. Последнее связано с адсорбцией
SIgA на
холерных вибрионах, что приводит к стойкому снижению количества вибрионов в
стуле больных и сокращает продолжительность их выделения из кишечника.
Концентрация этого иммуноглобулина и время его появления в кишечном содержимом
не связаны с сывороточным IgA. Количество IgG- и
IgM-антител в кишечном содержимом реконвалесцентов холеры также увеличивается
(в 5—7 раз), но в фекалиях антитела класса IgM не обнаруживают.
Для обнаружения антител в интестинальной жидкости и
фекалиях больных могут быть использованы ВТ, РИМ с холерными антигенами,
меченными радиоактивным йодом, непрямой флюоресцентно-серологический метод.
Нарастание специфических антител указывает на наличие заболевания холерой.
Однако кишечно-копрологическая диагностика холеры еще недостаточно
разработана.
В слюне больных и вибриононосителей повышен уровень
IgA и IgG. Одновременно появляются и специфические антитела (агглютинины),
содержание которых у больных холерой выше, чем у виброноносителей (30 АЕ и 14
АЕ соответственно). Диагностический титр специфических агглютининов слюны
может оказаться значительно ниже сывороточного.
Определению состояния повышенной чувствительности
при холере в реакции ГЗТ посвящены единичные работы. Описаны положительные аллергические
реакции у 89% переболевших холерой и вибриононосителей (при отсутствии их в
контрольной группе) в ответ на внутрикожное введение аллергена из убитых
холерных вибрионов. Однако имеющихся данных недостаточно, чтобы высказать
суждение об аллергической перестройке организма при холере или о
диагностической значимости применяемых тестов.
Иммунитет
После
болезни у человека вырабатывается выраженный иммунитет, который сохраняется
длительное время, поэтому случаи повторных
заболеваний холерой крайне редки. Опыты на
добровольцах показали, что в течение 3 лет (срок наблюдения) люди, переболевшие
холерой в результате экспериментального заражения, оставались устойчивыми к
повторному заражению холерными вибрионами
[Levine M. et al.,
1981].
Основная роль в иммунитете к
холере принадлежит антителам, продуцируемым местно (в кишке), хотя
определенный вклад в защиту вносят циркулирующие антитела при высоких их
концентрациях, когда они проникают в просвет кишки из крови, что подтверждено
экспериментами на животных. Более высокий уровень защиты наблюдается при
синергическом действии антибактериальных и антитоксических антител в кишке.
Основная роль антибактериальных SIgA состоит в том, чтобы
препятствовать хемотаксису вибрионов к эпителию и прилипанию их к поверхности
слизистой оболочки кишечника в результате блокирующего действия на структуры
для прилипания (лиганды) на поверхности бактериальных клеток. Снижение
колонизации и адгезии холерных вибрионов способствует более быстрому их выведению
из кишечника при перистальтике и тем самым уменьшает возможность приживления
возбудителя в кишечном тракте.
Действие кишечных
IgA-антител против холерогена обусловлено главным образом блокадой его
В-субъединицы, что препятствует связыванию токсина с ганглиозидом GM1 на
поверхности эпителиоцитов. Антитела, блокирующие токсический сайт на
А-субъединице холерогена, оказывают меньшее защитное действие.
Список использованной литературы
1. Л.Б. Хазенсон, Н.А. Чайка:
Иммунологические основы диагностики и эпидемологического анализа кишечных
инфекций. «Медицина»,1987.
2. В.Д. Тимаков, В.С.
Левашев, Л.Б.Борисов:
Микробиология. «Медицина», 1983.
3. Лекция по теме.
4. Методическая разработка
кафедры.